Гемагглютинин и нейраминидаза

Вирус гриппа человека выделен в 1933 г. Смитом, Эндрюсом и Лейдлоу путем заражения хорьков смывами носоглотки больного гриппом Вильсона Смита (отсюда название первого штамма WS).

Морфология. Вирус имеет сферическую форму, диа­метр вирусной частицы 80—120 нм (см. рис. 7, а). В пре­паратах свежевыделенных от больного вирусов встречают­ся нитевидные формы значительной длины. Вирус содержит липопротеидную оболочку, покрытую шипи-ками длиной около 10 нм. Шипики образованы двумя гликопротеидами — гемагглютинином и нейраминидазой. Шип гемагглютинина образован тремя молекулами белка, шип нейраминидазы образован четырьмя молекулами белка (рис. 43).

Внутренним компонентом вирионов является нуклео-капсид спиральной симметрии с диаметром около 9 нм. Он уложен в виде двойной спирали с диаметром 50—60 нм с односпиральной петлей на конце.

В соответствии с 8 фрагментами генома имеется 8 фрагментов нуклеокапсида. В составе вирионов между фрагментами существует слабая связь.

Химический состав и физико-химические свойства.Вирус содержит по массе 1—2%РНК, 50—70% белков, 18—37% липидов, 5—9% углеводов. Липиды содержатся в липопротеидной оболочке, углеводы — в составе гликопротеидов. И липиды и углеводы имеют клеточное проис­хождение.


Гемагглютинин и нейраминидаза

Рис. 43. Строение вириона гриппа (схема). а—мономер гемагглютинина: 1—малая субъединица гемагглютинина; 2— большая субъединица гемагглютинина; 3— место нарезания гемагглютинина-. предшественника; 4— С-конец малой гемагглютинирующей субъединицы, погруженный в липиды; 5— N-конец большой гемагглютинирующей субъеди­ницы, взаимодействующий с рецепторами клетки; б— антигенная детерминанта;

6 — тример гемагглютинина; в — мономер нейраминидазы; 7— гидрофильный участок нейраминидазы; 8 — стержень нейраминидазы; 9 — гидрофобный участок нейраминидазы; г — тетрамер нейраминидазы; 10 — нейраминидаза в составе вириона; 11—гемагглютинин в составе вириона; 12—липидный бислой наружной оболочки вириона; 13 — слой матриксного белка; 14 — рибонуклеопротеид.

Молекулярная масса вирусной частицы 250- 106, плавучая плотность в сахарозе 1,19 г/см3. Фрагменты нуклеокапсида имеют длину от 50 до 130 нм; плавучая плотность нуклеокапсида в хлориде цезия 1,34—1,35 г/см3.

Геном. Геном представлен 8 фрагментами однонит­чатой линейной «минус-нитевой» РНК. Молекулярная масса отдельных фрагментов от 0,2- 106 до 1- 106, общая молекулярная масса 5- 106. Каждый фрагмент, за исключением 7-го и 8-го, кодирует один белок, фраг­менты 7 и 8 кодируют по два белка с уникальными последовательностями аминокислот, благодаря сплайсингу и сдвигу рамки при трансляции.


Определена первичная структура всех генов вируса гриппа.

Белки, антигены. В составе вируса гриппа содержится 7 белков.

Белки р[, Pa, Рз названы по первой букве слова «по-лимераза», поскольку предполагалось, что все три являют­

ся субъединицами РНК-полимеразы. На самом деле, РНК-полимеразой является белок Pi. Белок Рз обладает свой­ствами эндонуклеазы, «откусывая» «шапочку» у клеточных иРНК вместе с 10—13 прилегающими нуклеотидами и перебрасывая ее на 5/-кoнeц вирусного транскрипта. Функции белка Рг неизвестны. Белки Pi и Рз обладают основными свойствами, а белок ?2 — кислыми, поэтому их еще называют PBi (Pi), PB2 (Рз) и РА (Рз). Все три белка находятся в составе нуклеокапсида и образуют комплекс, интимно связанный с геномом.

Мономер гемагглютинина имеет форму палочки длиной 14 нм и диаметром 4 нм, которая одним концом (С-конец легкой цепи) погружена в липидный бислой (рис. 44). Субъединица гемагглютинина представляет собой тример.

Гемагглютинин синтезируется в виде предшественника, который нарезается протеолитическими ферментами на две субъединицы, тяжелую цепь (НА1) и легкую (НА2) с молекулярными массами примерно 50 000 и 25 000, связанные дисульфидными связями.


С помощью рентгеноструктурного анализа кристал­лизованного НА, сделанного Д. Скейлом с соавт., предло­жена его пространственная модель. Согласно этой модели в тримере НА обнаруживаются два структурных участ­ка — стебель и глобула. Глобула содержит антигенный и рецепторный участки (см. рис. 44). Она состоит только из НА1, а стебель — из обеих субъединиц (НА1 и НА2).

Обнаружено четыре предполагаемые зоны антигенов А, В, С, D. Зона антигена А является петлей, которая образуется между тримерами. Эти зоны соответствуют четырем антигенным детерминантам. Все они связаны с тяжелой цепью гемагглютинина. Две из них являются последовательными, а две образуются при взаимодействии мономеров. Третья обусловлена третичной структурой, четвертая — четвертичной структурой и формируется путем взаимодействия трех мономеров (см. рис. 44). Наиболее активными антигенными детерминантами яв­ляются 1-я и 2-я.

Гемагглютинин является основным специфическим антигеном вируса, определяющим, наряду с нейрамини-дазой, подтип вируса и вызывающий образование про-тективных антител. Свойство гемагглютинина антиген­ной изменчивости обусловлено двумя генетическими процессами — дрейфом и шифтом. В результате’ дрейфа происходят незначительные изменения генаНА, обуслов­ленные точечными мутациями, а — антигенные свойства

 
 
Гемагглютинин и нейраминидаза

Гемагглютинин и нейраминидаза

Рис. 44. Гемагглютинин вируса гриппа.

а — тример с четырьмя антигенными детерминантами (черные квадратики^ и участком взаимодействия с клеточным рецептором (белый квадратик — рецепторный карман); б — структура мономера по данным рентгеноструктур-ного анализа. Цифры обозначают порядковый номер аминокислот, кружки, квадраты и треугольники—4 антигенные детерминанты (А, В, С и D), 1—’ место нарезания предшественника (N-конец. малой субъединицы), S-S-дисуль" фидные связи.

меняются незначительно, но при продолжительном периоде циркуляции вируса под влиянием коллективного иммунитета селекционируются варианты, значительно отличающиеся по антигенным свойствам от прототипного штамма. Шифт возникает в результате полной смены гена и обусловлен их пересортировкой при одновременной репродукции в клетке двух вирусов гриппа.

Вирус агглютинирует эритроциты кур, морских свинок, человека и многих других видов животных. При низких значениях рН (5,0—5,5) вирус вызывает гемолиз эритро­цитов.

Нейраминидаза является ферментом, катализирующим отщепление сиаловой кислоты от субстрата. Мономер нейраминидазы под электронным микроскопом имеет вид


барабанной палочки и состоитиз головки, обращенной кнаружи, размером 4Х4Х4 нм и ножки длиной 10 нм. Соединение двух мономеров происходит за счет дисуль-фидных связей, а двух димеров в тетрамере — за счет межмолекулярных связей. Активные центры и антигенные детерминанты находятся на головках мономеров.

Нейраминидаза может изменяться независимо от гемагглютинина, в основе антигенной изменчивости также лежат процессы дрейфа и шифта. Антитела против нейраминидазы не оказывают такого защитного дей­ствия, как антитела против гемагглютинина, однако, они частично нейтрализуют вирус и ослабляют инфекционный процесс.

Нуклеопротеид (NP) — основной внутренний белок вируса, формирующий субъединицы капсида.Он интимно связан с геномом в течение всего периода репродукции вируса, но не препятствует экспрессии генома. Этот белок является типоспецифическим антигеном, общим для всех вирусов типа А. Антитела к NP не оказывают защитного действия и применяются с целью диагностики инфекции.

Матриксный белок — самый низкомолекулярный белок в составе вириона, локализованный на внутренней поверх­ности липопротеидной мембраны вируса. m|-белок играет роль медиатора при сборке вирусной частицы. Mi-белок является стабилизирующим фактором, при его отсутствии или уменьшении концентрации вирусная частица стано­вится хрупкой и быстро распадается.

Матриксный белок, как и NP, является типоспецифи­ческим антигеном, общим для всех вирусов типа А. Белок М2, который кодируется тем же седьмым геном, является неструктурным и локализован в клеточной оболочке.


Белки ns] и NSz — неструктурные вирусные белки, которые хотя и кодируются одним (восьмым) геном, имеют уникальные последовательности аминокислот благодаря трансляции со сдвигом рамки. Белок ns) синтезируется на самых ранних этапах репродукции. В ядре и цитоплазме он накапливается в больших коли­чествах и образует включения.

Чувствительность к физическим и химическим факто­рам. Вирус гриппа относительно стабилен и может сохра­няться при температуре 4° С в течение недели. Инфек­ционная активность сохраняется продолжительное время при хранении при температуре —70° С. Прогревание при температуре 50—60° С уничтожает его активность

в течение нескольких минут. Вирусы чувствительны к эфи­ру, детергентам. При низких значениях рН (3,0 и ниже) инфекционная активность теряется.

Репродукция. Вирус адсорбируется на клеточных рецепторах, содержащих сиаловую кислоту (гликопро-теидах или ганглиозидах). Проникновение вируса в клетку Осуществляется обычно по механизму рецепторного Эндоцитоза с последующим слиянием вирусной мембраны со стенкой вакуоли и выходом нуклеокапсида в цито­плазму, а затем в ядро. Слияние происходит при низких значениях рН, которые создаются в эндоцитарной вакуо­ли — рецептосоме. Транскрипция и репликация генома происходят в ядре в составе нуклеокапсида.


Затравкой для транскрипции является КЭП, «шапоч­ка», которая вместе с 10—13 нуклеотидами отрезается от клеточных и РНК, находящихся в ядре (отсюда необ­ходимость ядерной локализации транскрипции), и пере­брасывается на 5′-конец вирусного транскрипта.

На ранней стадии с наибольшей скоростью синтези­руются иРНК для белков NS и NP, на поздней стадии — иРНК для белков НА, NA, М. Соответственно белки NS и NP являются ранними, а НА, NA и М — поздними. Белки Р синтезируются на протяжении инфекционного цикла с одинаковой скоростью.

Нуклеокапсиды транспортируются из ядра в цитоплаз­му и затем к клеточной оболочке к тем ее модифици­рованным участкам, на которых снаружи находятся вирус­ные гликопротеиды, а со стороны цитоплазмы — Mi-белок. Вирус выходит из клетки путем почкования.

Патогенез и клиника. Вирус гриппа попадает в орга­низм через дыхательные пути вместе с каплями влаги и частицами пыли. Чем меньше величина капель и частиц, тем глубже проникает вирус в дыхательные пути. Благо­даря короткому инфекционному циклу вируса (6—8 ч) при попадании в верхние дыхательные пути одной вирус­ной частицы уже через 8 ч количество инфекционного потомства достигает 103, а к концу первых суток — 1027. Эти расчеты объясняют столь короткий инкубационный период при гриппе — 1—2 сут. Репродукция вируса происходит в клетках эпителия слизистой оболочки дыхательных путей.

Может развиться первичная пневмония с некрозом Эпителия бронхиол. Пораженные клетки отторгаются, а продуктыих распада всасываются, попадают в кровь, вызывая интоксикацию организма и лихорадочное состоя­


ние. Вирус проникает в кровь и разносится по всему организму. Активация вирусом всей системы протеолиза и повреждение клеток эндотелия капилляров приводит к повышенной проницаемости сосудов, кровоизлияниям и дополнительному повреждению ткани. Возникают патологические изменения в почках, мозге. В результате повышенной проницаемости сосудов может возникнуть отек мозга с летальным исходом. Это случай так назы­ваемого молниеносного гриппа, когда смерть наступает на 2—3 сут. Вирус гриппа, попадая в кровь, вызывает угнетение кроветворения и иммунной системы, развивается лейкопения, может присоединиться интеркурентное забо­левание, наблюдаются осложнения, вызванные бакте­риями и другими вирусами — затяжные риниты, гнойные синуситы, отиты, вторичные вирусные бронхиты и. пнев­монии.

Однако описанное беспрепятственное распространение вируса в организме имеет место далеко не во всех слу­чаях и может быть приостановлено при включении в про­цесс факторов неспецифического и специфического имму­нитета, таких как неспецифические ингибиторы, находя­щиеся в крови, имеющиеся у больных антитела, интерферон. В результате развитие вирусной инфекции замедляется или прерывается, а через несколько суток появляются специфические антитела класса IgM, которые «защищают» организм. Антитела класса IgG появляются лишь спустя 2 нед после начала заболевания и их роль состоит в защи­те против повторного заражения данным серовариантом вируса гриппа.


Для клинического течения гриппа характерно быстрое развитие инфекции с высокой температурой, общей интоксикацией, воспалительными процессами в дыхатель­ных путях. Температура достигает 38—39° С и более. Общая интоксикация выражается в головной боли, боли в глазных яблоках, резком угнетении. Развиваются симп­томы местного поражения дыхательных путей — насморк, кашель, боли за грудиной. Поражение эндотелия стенок кровеносных сосудов приводит к точечным кровоизлия­ниям в верхних дыхательных путях, трахее, бронхах. Если развивается первичная гриппозная пневмония, она имеет геморрагический характер, и мокрота содержит прожилки крови.

Иммунитет. Пассивный иммунитет, передаваемый от матери, сохраняется у детей на протяжении первых месяцев жизни. После перенесенного заболевания возни­кает стойкий иммунитет.

Повторные заболевания гриппом обусловлены не кратковременностью иммунитета, а появлением новых серовариантов вируса гриппа, против которых у населения нет иммунитета.

В иммунитете против гриппа большую роль играют антитела классаIgA, накапливающиеся в секрете слизис­той оболочки полости носа.

Эпидемиология. Эпидемиология гриппа своеобразна и не имеет аналогов среди других инфекционных заболе­ваний. Грипп передается воздушно-капельным путем. Больной или носитель (часть зараженных переболевает гриппом в инаппарантной или стертой форме) выделяют вирус вместе со слизью носоглотки и верхних дыхатель­ных путей не только при кашле и чиханье, но и при разговоре.


к как инкубационный период болезни очень короток и не превышает 1—2 дней, то возникшая эпиде­мия распространяется довольно быстро, охватывая все новые и новые восприимчивые контингенты населения. Дальнейшее развитие эпидемии регулируется иммуните­том, который развивается после болезни через 1—1 ‘/2 нед, и поэтому по мере нарастания иммунной прослойки эпи­демия гриппа идет на убыль. В условиях даже большого города на это уходит около месяца, а при нынешних широких связях между странами и быстрых транспортных средствах эпидемии гриппа в течение немногих месяцев охватывают население многих стран, нередко — все полу­шарие или даже всю планету. Такие обширные эпидемии называются пандемиями.

Причиной повторных эпидемий гриппа и повторных заболеваний является уникальная изменчивость белков вирусов гриппа (гемагтлютинина и нейраминидазы) в результате шифта и дрейфа. Люди, болевшие ранее гриппом, полностью восприимчивы к новому сероварианту вируса, к которому нет коллективного иммунитета, он начинает безудержно распространяться среди населения всего земного шара, вызывая пандемию гриппа.

Первая достоверно документированная пандемия гриппа (ретроспективно мы знаем, что это был грипп типа А) возникла в 1889 г. Предполагается, что она началась в Китае, а затем в течение ближайших 1 ‘/2— 2 лет распространилась на все страны мира.

Следующая пандемия гриппа возникла через 29 лет — в 1918 г. За два года она распространилась во все страны мира и от нее погибло около 20 млн. человек. Никогда до этого и после этого грипп не протекал так тяжело.

На основании иммунологических исследований было установлено, что пандемия была вызвана вирусом, цирку­ляция которого к началу 30-х годов прекратилась среди людей и вирус был выделен от свиней. Эта пандемия началась в Китае, но он получил название «испанского» гриппа, так как первые упоминания о тяжелой эпидемии появились в Испании. Вирус, вызвавший эту эпидемию, в настоящее время обозначается H1N1. После 1918 г. эпидемии гриппа типа А повторялись через 2—3 года, а гриппа типа В — через 4—6 лет. В 1947—1949 годах возникла пандемия гриппа типаА, которая медленно распространялась и в течение 3 лет прошла во всех странах мира. Следующая пандемия получила название азиатской, а вызвавший ее вирус назвали вирусом азиат­ского гриппа. Эта пандемия, как и две предшествовавшие, началась в Китае (первый вирус, однако, был выделен в Сингапуре) в 1957 г. и к концу года охватила весь мир, вызвав заболевание от 1,5 до 2 млрд. человек. Панде­мия была вызвана новым серовариантом вируса гриппа с антигенной формулой H2N2 (вирус азиатского гриппа). Одновременно перестал циркулировать вирус H1N1.

В дальнейшем эпидемии гриппа стали наблюдаться почти ежегодно, отличаясь степенью интенсивности — в зимние месяцы в северном полушарии, в летние меся­цы — в южном полушарии. Новая пандемия разразилась через 11 лет, в 1968 г. она также началась в Китае и была вызвана вирусом, получившим название «гонконгского» по месту его выделения. Пандемия развивалась стреми­тельно и поразила не менее 1 млрд. человек. Пандемию вызвал новый серовариант — гонконгский вирус гриппа с антигенной формулой H3N2, и одновременно перестал циркулировать среди людей азиатский вирус гриппа H2N2.

В 1977 г. произошло необычайное событие — «возвра­тился» вирус H1N1 после 20-летнего отсутствия. И на этот раз эпидемия началась в Китае. Заболевали почти исключительно лица моложе 20 лет, т. е. родившиеся после 1957 г., когда прекратилась циркуляция этого вируса среди населения. Другой особенностью явилось то, что предшествующий вирус (H3N2) не исчез, а также продолжал циркулировать и были выделены штаммы-рекомбинанты, содержавшие гены обоих вирусов. Вирус, вызвавший пандемию, получил название А/СССР/77, так как он впервые был выделен советскими учеными и не­медленно переданВОЗ. Позже выяснилось, что сходные

Гемагглютинин и нейраминидаза

вирусы были выделены летом 1977 г. в Китае. История пандемий показана на рис. 45.

Начав циркулировать среди населения, новый вариант вируса не остается стабильным: его гликопротеиды НА и NA из года в год претерпевают антигенный дрейф, который приводит к тому, что через 2—3 года, а иногда и ранее выработанный иммунитет обеспечивает лишь частичную защиту от заболевания. Коллективный имму­нитет (иммунологический пресс) является тем фактором, в результате которого селекционируются новые антиген­ные варианты, т. е. является движущей силой антигенного дрейфа.

По основному вопросу — источнику появления новых вариантов вируса гриппа в результате шифта — суще­ствуют две основные концепции. Согласно одной из них варианты, исчезнувшие из человеческой популяции, на самом деле продолжают циркулировать среди населения. Фактов, подтверждающих это предположение, нет. Другая гипотеза объясняет появление новых антигенных вариан­тов возвращением в человеческую популяцию вирусов, циркулирующих у животных. Во время эпидемии человек массивно выделяет вирус гриппа в биосферу и эпидемии и пандемии гриппа обычно сопровождаются эпизоотией среди домашних и диких животных, особенно птиц. Установлены экологические и эволюционные связи между вирусами человека и животных, и (благодаря секвени-рованию гена гемагглютинина) природа шифтов, которые привели к появлению азиатского и гонконгского серо-вариантов вирусов. Азиатский вирус сохранил четыре гена своего предшественника H1N1 — гены р|, Р2, Рз и NP, и получил новые четыре гена от предполагаемого партнера — гены НА, NA, M и NS. У гонконгского виру­са H3N2 остались неизменными семь генов предшествен­ника и только один ген НА был заменен в ходе реком­бинации. Возможными источниками этого гена были названы два вируса: вирус Hav7Neq2, выделенный от уток на Украине, и вирус Heq2Neq2, выделенный от ло­шадей в Майами (США).

Лабораторная диагностика. Материалом для иссле­дования является отделяемое носоглотки, которое берут в первые 3 дня болезни ватными или марлевыми тампо­нами с задней стенки глотки, и мазки-отпечатки слизис­той оболочки носовой полости. В летальных случаях используют кусочки пораженной легочной ткани, соскоб слизистой оболочки трахеи и бронхов.

Быстрая диагностика основана на выявлении вирусного антигена в эпителии слизистой оболочки верх­них дыхательных путей. Наиболее широко используют метод ИФ. Антиген выявляют в мазках-отпечатках или эпителии, полученных из отделяемого носоглотки с по­мощью прямого и непрямого методов, используя коммер­ческие флюоресцирующие иммуноглобулины. Специфи­ческий антиген обнаруживается в цитоплазме в виде ярко светящихся конгломератов. Серологический вариант вируса гриппа (типов А, В или С) можно определить с помощью ИФ. Разработаны методы быстрой диагностики с помощью непрямой иммуноферментной реакции, осно­ванные на идентификации типоспецифических антигенов (M и NP) в смывах носоглотки больных.

Выделение вируса. В связи со сменой серо-вариантов вируса гриппа желательно выделение его при вспышках и эпидемиях. Основным методом выделения вируса гриппа из смывов носоглотки является заражение 10—11-дневных куриных эмбрионов в амнион.

Идентификацию вируса проводят в РТГА или в РСК.

В сыворотках животных содержится большое коли­чество неспецифических ингибиторов гемагглютинации, как термолабильных, которые разрушаются при прогре­вании сывороток при температуре 58°С, так и термо­стабильных. Вирусы гриппа могут быть как чувствитель­ными, так и устойчивыми к ингибиторам. В первом случае иммунные сыворотки для удаления ингибиторов обраба­тывают углекислотой, перийодатом калия или фильтратом холерного вибриона. Вирусы гриппа агглютинируют эритро­циты с разной интенсивностью (авидностью) и в зависи­мости от этого их делят на авидные и неавидные штаммы. Для неавидных штаммов лучше использовать эритроциты человека группы 0. Для выделения вируса используют также культуры клеток эмбриона человека (почек и легких), почек обезьяны, МДСК и др. Индентификацию вируса проводят в РТГА, ИФ.

Серологическая диагностика заключается в обнаружении прироста антител в парных сыворотках больных. Используют РСК и РТГА, в качестве антигенов используют стандартные диагностикумы. Во второй сыво­ротке больного может быть обнаружен прирост антител сразу к двум или большему количеству используемых антигенов. В этом случае возбудителем заболевания считают тот штамм, к которому во второй сыворотке выявлен наивысший титр антител. Серологическую диаг­ностику осуществляют также с помощью РН и ИФ в культуре клеток, реакции преципитации в геле, РРГ, ИФА. В РН используют наиболее чувствительные к вирусу культуры клеток почек собаки (MDCK) или быка (MDBK), а также клетки почек человека и обезьяны.

Профилактика и лечение. Применяются как убитые, так и живые вакцины. Те и другие имеют свои преиму-.щества и недостатки. Получение вакцинных штаммов основано на следующих принципах. Заранее приготавли­вается вирус-носитель, который обладает всеми необхо­димыми свойствами и хорошо размножается в лабора­торных условиях (куриных эмбрионах). Используя тех­нику рекомбинаци, от «актуального» вируса вирусу-носителю пересаживают только два гена — НА и NA, определяющих иммунологические свойства вируса. Для получения убитой вакцины вирус выращивают обычно на куриных"’ эмбрионах, затем очищают от примесей, концентрируют и инактивируют, формальдегидом или другими химическими и физическими воздействиями, например, ультрафиолетовым облучением. При правильном подборе вакцинных штаммов вакцины снижают заболе­ваемость среди привитых в 2’/2—3 раза по сравнению с непривитыми. В качестве вируса-носителя для живых вакцин перспективно использование «холодовых» мутан­тов, которые неспособны к репродукции при температуре 37° С, но хорошо размножаются при более низких темпе­ратурах, свойственных слизистой оболочке носоглотки (32—34° С). При этом создаются условия для репродук­ции вакцинного штамма в эпителии носоглотки, а не легочных альвеол. Для детей младшего возраста, а также лиц пожилого возраста, страдающих хроническими забо­леваниями, разрабатываются вакцины со сниженной реактогенностью. Такие вакцины получают путем расщеп­ления вирионов и выделения гемагтлютинина и нейра-минидазы (субъединичные вакцины). Для лечения и про­филактики гриппа применяют химиопрепараты — аман-тадин и ремантадин. Последний является менее токсичным препаратом, его назначают внутрь в дозе 150—300 мг

в сутки в течение 2—3 дней. Лечение следует начинать как можно раньше после начала заболевания. Для лече­ния и профилактики гриппа используют интраназальное введение интерферона.

Источник: studopedia.ru

98.    Ортомиксовирусы (семейство Orthomyxoviridae). Общая характеристика и классификация. Вирусы гриппа человека, структура вириона, особенности генома. Гемагглютинин, нейраминидаза, их локализация, строение, классификация, функциональная активность. Роль персистенции вируса в организме человека и животных в сохранении эпидемиологически значимых штаммов. Иммунитет. Лабораторнаядиагностика.Специфическаяпрофилактикаилечение.

Ортомиксовирусы (вирусы гриппа)

Таксономия. Ортомиксовирусы (семейство Orthomyxoviridae, от греч. orthos — прямой, правильный, туха — слизь) — РНК-содержащие сложноорганизованные вирусы. Семейство включает в себя 5 родов: род Thogotovirus(передаваемые клещами арбовирусы), род Isavirus (вирус инфекционной анемии лосося) и три рода вирусов гриппа — Influenzavirus А, Influenzavirus В и Influenzavirus С.

 

Наибольшее значение в патологии человека имеют вирусы гриппа, среди которых наибольшим антигенным разнообразием и эпидемической опасностью обладают вирусы гриппа А.

Грипп (от старофранц. Grippe — схватывать, царапать) — острое инфекционное вирусное заболевание человека, характеризующееся поражением респираторного тракта, лихорадкой, общей инток- сикацией, нарушением деятельности сердечно-сосудистой и нервной систем. Впервые симптомы болезни описали Гиппократ и Тит Ливий в 412 г. до н.э.

История выделения возбудителя. Вирус гриппа от человека был впервые выделен в 1933 г. английскими вирусологами У. Смитом, К. Эндрюсом и П. Лейдлоу путем заражения хорьков носоглоточными смывами больного гриппом. Позже этот вирус был отнесен к типу А. В России вирус гриппа типа А впервые выделили А.А. Смородинцев в 1936 г. в Ленинграде и Л.А. Зильбер в Москве. В 1940 г. Т. Френсис и Т. Меджил открыли вирус гриппа типа В. В 1947 г. Р. Тейлор выделил вирусы гриппа типа С.

Строение и репродукция вирусов. Вирион имеет сферическую форму, могут встречаться нитевидные формы значительной длины. Диаметр вирусной частицы 80-120 нм. Вирион представляет собой нуклеокапсид (имеющий спиральный тип симметрии), по- крытый липопротеиновой оболочкой.

Нуклеокапсид вирусов гриппа содержит однонитевую сегментированную минус-нитевую РНК (вирусы А и В имеют 8 сегмен- тов, вирус С — 7) в комплексе с белком нуклеопротеином (NP), причем каждый сегмент еще соединен с тремя белками полимеразного комплекса (РВ1, РВ2, РА). На основе каждого из сегментов создается комплементарная мРНК для синтеза вирусных белков.

Первый сегмент кодирует полимеразный белок PB1 и благодаря дополнительной рамке считывания белок PB1-F2, который имеет сродство к митохондриям и участвует в запуске апоптоза инфицированной клетки. Второй и третий сегменты кодируют белки PB2 и РА соответственно. Данные белки полимеразного комплекса необходимы для осуществления транскрипции и репликации вирусного генома. Четвертый сегмент вирусной РНК кодирует ге- магглютинин, который синтезируется сначала в виде единой полипептидной цепи, а затем подвергается химическим модификациям, расщепляется на две субъединицы и в результате приобретает способность осуществлять слияние вирусной оболочки с клеточной мембраной. Пятый сегмент РНК вируса гриппа кодирует NP- белок, некоторые участки которого способны связываться с РНК. Шестой сегмент у вирусов гриппа А и В кодирует нейраминидазу (а у вирусов В еще и гликопротеин NB, участвующий в транспорте ионов). Седьмой сегмент у вируса гриппа А кодирует белки М1 и М2. Белок М1 образует внутренний слой оболочки вириона, а белок М2 своей центральной трансмембранной частью формирует канал для транспорта ионов внутрь вирусной частицы. Формирование таких каналов является необходимым условием для отделения нуклеокапсида от белка М1 при проникновении вирусного генома в клетку. У вирусов гриппа В и С седьмой сегмент кодирует белки ВМ2 и СМ2 соответственно, а также белок М1. Белки ВМ2 и СМ2 отличаются по своей структуре от белка М2 у вируса гриппа А. Восьмой сегмент кодирует белки NS1 и NS2 (или NEP), которые защищают вирусы от воздействия интерферона (NS1) и участвуют в транспорте синтезированных в ходе репродукции нуклеокапсидов из ядра клетки в цитоплазму (NS2). Сегментированная РНК вирусов предрасположена к генетическим рекомбинациям.

 

Нуклеокапсид у вирусов гриппа окружен слоем белков М1, которые составляют внутренний слой липопротеиновой оболочки. Липопротеиновая оболочка (суперкапсид) имеет клеточное происхождение. Суперкапсид включает в себя вирусные трансмембранные белки (такие, как М2, NB, ВМ2, СМ2) и несет на своей поверхности шипики, образованные двумя сложными белкамигликопротеинами — гемагглютинином (НА) и нейраминидазой (NА). В каждом вирионе количество гемагглютинина во много раз больше, чем нейраминидазы. У вирусов типа С нейраминидазы нет. Шипики — это выросты длиной около 10 нм, шип гемагглю-

тинина — тример, т.е. состоит из 3 молекул белка, соединенных вместе, шип нейраминидазы — тетрамер, т.е. состоит из 4 молекул белка. На поверхности обоих гликопротеинов есть специальные области для связывания с рецепторами на чувствительных клетках. Для вирусов гриппа специфическими рецепторами являются соединения, содержащие сиаловую кислоту. Так как на мембранах клеток состав сиалоолигосахаридов разный, существует видовая и тканевая специфичность клеточных рецепторов, кроме того, у молекул гемагглютинина разных вирусов может быть разное строение «рецепторного кармана», что ограничивает круг хозяев разных вариантов вирусов гриппа А.

Взаимодействие вирусов гриппа с клеткой начинается с того, что гемагглютинины связываются с рецепторами, а затем нейраминидаза отщепляет от них сиаловую кислоту и затем вирус проникает в клетку путем эндоцитоза. Далее происходят слияние оболочки вируса с мембраной эндосомы, частичная депротеинизация вируса и нуклеокапсид выходит в цитоплазму, а затем транспортируется в ядро клетки. В ядре клетки происходит транскрипция генов, в которой участвуют белки полимеразного комплекса. Синтез и процессинг клеточных мРНК представляют собой сложный процесс, в результате которого минус-нить каждого сегмента вирусной РНК трансформируется в комплементарные плюс-нити. мРНК транспортируются в цитоплазму, где и кодируют синтез соответствующего белка на рибосомах. При репликации генома вируса, которая идет в ядре клеток, транскрибируется вся нить сегмента РНК. Сначала образуется плюс-нить, затем на матрице образуется минус-нить РНК для дочерних вирусов. Сборка нуклеокапсида происходит в ядре, куда к этому времени транспортируются синтезированные капсидные белки (NP и белки полимеразного комплекса).

 

Гемагглютинин, нейраминидаза, а также М-белки в процессе репродукции вирусов встраиваются в мембрану клетки-хозяина, а так как формирование вирусных частиц идет на клеточных мембранах, в которые к этому времени уже встроены гемагглютинин и нейраминидаза, то, выходя из клетки путем почкования, вирусы покрываются оболочкой, уже содержащей НА-, NА- и М-белки. При выходе вирусов из клетки проявляется еще одна важная функция нейраминидазы — она препятствует аггрегации новых вирионов. Кроме того, она снижает вязкость секретов, и вирусы легче проникают в нижние отделы респираторного тракта.

Антигенная структура. Вирусы гриппа имеют внутренние и поверхностные антигены. Внутренние типоспецифические антигены представлены нуклеопротеином (NP-белком) и М-белками. Поверхностные антигены — это гемагглютинин и нейраминидаза. Антитела к поверхностным антигенам обладают защитным свойством при гриппе. Структура поверхностных антигенов вирусов гриппа А постоянно изменяется, причем изменения НА- и NА-белков происходят независимо друг от друга. В настоящее время известны более 15 подтипов гемагглютинина и 9 подтипов нейраминидазы, но от человека стабильно выделяются только Н1, Н2, Н3 и N1, N2. Вирус гриппа В более стабилен, хотя все же имеет несколько разновидностей. Наиболее стабильной антигенной структурой обладает вирус гриппа С.

Изменчивость вирусов гриппа А, приводящая к образованию все новых антигенных вариантов, объясняется двумя процессами, которые получили названия «антигенный дрейф» и «антигенный шифт».

Антигенный дрейф — это незначительные изменения структуры гемагглютинина и/или нейраминидазы, которые происходят часто и обусловлены точечными мутациями в тех участках генома вируса, которые отвечают за синтез и структуру детерминант поверхностных антигенов. В результате в популяции вирусов постоянно появляются новые антигенные варианты, которые и обусловливают периодические эпидемии гриппа, потому что через несколько лет циркуляции любого штамма вируса гриппа среди людей структура его поверхностных протективных антигенов так изменяется, что выработанный ранее иммунитет только частично защищает от заболевания.

 

Антигенный шифт (shift — скачок) — это появление новой разновидности гемагглютинина и/или нейраминидазы, которое обусловлено пересортировкой (реассортацией) и полной заменой гена, кодирующего или гемагглютинин, или нейраминидазу определенной разновидности. Шифт происходит редко и обычно является результатом рекомбинаций, возникающих при заражении одной клетки двумя разными вирусами одного и того же рода (например, от человека и от животных). В результате полностью изменяется структура антигена и образуется гибридный вирус-реассортант. Если возникший в результате шифта новый штамм вируса гриппа адаптируется к существованию в организме человека, то он ста-

новится причиной пандемии, так как человеческая популяция не имеет к нему иммунитета.

Резистентность. В окружающей среде устойчивость вирусов средняя. Вирусы гриппа чувствительны к высоким температурам (выше 60 ?С), УФ-облучению, жирорастворителям, но могут некоторое время сохраняться при низких температурах — в течение недели не погибают при температуре около 4 ?С. Вирусы чувстви- тельны к табельным дезинфектантам.

Эпидемиология. Грипп — антропонозная инфекция. Основной механизм передачи — аэрогенный, путь передачи воздушнокапельный (при кашле, чиханье и т.п.). Также возможна контактная передача (например, при прикосновении к слизистой оболочке носа пальцами, контаминированными вирусом).

Грипп — высококонтагиозное заболевание и часто протекает в виде эпидемий и даже пандемий, восприимчивость людей очень высокая. Чаще и тяжелее болеют дети, как не имеющие стойкого противогриппозного иммунитета. Но смертность выше среди взрослых, особенно из так называемой группы риска (пожилые люди, больные с хроническими заболеваниями органов дыхания и сердечно-сосудистой системы, лица с ослабленной резистент- ностью и т.д.). Вспышки инфекции легко возникают в замкнутых коллективах.

 

Наибольшее эпидемиологическое значение имеют вирусы гриппа А: они поражают и людей, и животных (в том числе птиц), вызы- вают эпидемии и даже пандемии с высокой смертностью. В ХХ веке наиболее известны три пандемии гриппа А: в 1918 г. — так называемая испанка, возбудителем был вирус гриппа А (Н1N1), погибли более 20 млн человек; в 1957 г. — азиатский грипп, возбудителем стал вирус гриппа А (Н2N2), болели 1,5-2 млрд человек; в1968 г. — гонконгский грипп, пандемическим штаммом стал вирус гриппа А (Н3N2), болели около 1 млрд человек. Вирусы гриппа В обычно поражают людей и редко животных, способны вызывать лишь эпидемии, но никогда не вызывали пандемии. Эпидемии гриппа В происходят раз в 3-5 лет. Вирусы гриппа С встречаются редко и обычно вызывают только спорадические заболевания, чаще у детей.

В последние годы в эпидемическом процессе одновременно участвуют вирусы гриппа А (Н3N2 и Н1N1), а также вирус гриппа типа В. Поэтому именно такие разновидности вирусов включены в состав современных вакцин для профилактики гриппа.

Однако, несмотря на создание профилактических средств, грипп относят к числу неуправляемых инфекций, поэтому так важна соз- данная ВОЗ программа глобального эпидемиологического надзора за гриппом, в которой участвует и Россия.

Патогенез. Обычно входные ворота инфекции — это верхние дыхательные пути, но вирус может проникнуть сразу в альвеолы, что вызывает развитие пневмонии. Первичная репродукция вирусов происходит в клетках эпителия респираторного тракта. Инфицированные клетки начинают вырабатывать интерферон, оказывающий неспецифическое противовирусное действие. Развиваются воспаление, отек, набухание базальной мембраны, происходит десквамация клеток поверхностного эпителия. Через поврежденные эпителиальные барьеры вирус гриппа А проникает в кровоток и вызывает виремию. Всасывание продуктов распада клеток также оказывает токсическое и сенсибилизирующее действие на организм. Вирус активирует систему протеолиза и вызывает повреждение эндотелия капилляров. Это повышает проницаемость сосудов и серозных оболочек, что вызывает геморрагии и нарушение гемодинамики с расстройствами микроциркуляции. При гриппе также развивается транзиторный вторичный иммунодефицит, что предрасполагает к развитию вторичной бактериальной инфекции.

 

Клиническая картина. Инкубационный период 1-2 дня. Клинические проявления в течение 3-7 дней, реконвалесценция — 7-10 дней. При гриппе А начало болезни острое, у больного обычно наблюдается интоксикация (высокая лихорадка с ознобом, суставные и мышечные боли, сильная головная боль). Вирус гриппа А нейротропен, поэтому возможно развитие нейротоксикоза, в результате чего может наступить смерть (чаще у детей). Развивается катар верхних дыхательных путей (саднящий сухой кашель, боли за грудиной, нарушение фонации, ринит и ринорея). Характерен геморрагический синдром — кровоизлияния в кожу, серозные и слизистые оболочки и внутренние органы, повышенная кровоточивость. Опасное осложнение — геморрагическая пневмония и отек легких. Редко и чаще у детей бывает абдоминальный синдром (боли в животе, тошнота, рвота, диарея). Осложнения при гриппе проявляются в виде бактериальной суперинфекции. Грипп А также может осложняться нарушениями функций нервной, сердечнососудистой систем, печени, почек и др. Грипп В обычно протекает легче, чем грипп А, и может сопровождаться такими симптомами,

как конъюнктивит, глазная боль или фотофобия. Кроме того, вирус гриппа В не обладает нейротропностью. Заболевание, вызван- ное вирусами гриппа С, чаще протекает легко.

Иммунитет. Во время заболевания в противовирусном ответе участвуют факторы неспецифической защиты организма, α-интерферон, специфические IgA в секретах респираторного тракта, которые обеспечивают местный иммунитет. Протективные вируснейтрализующие специфические сывороточные антитела появляются на 7-8-й день болезни и достигают максимального уровня через 2-3 нед. В ходе реконвалесценции важна роль клеточного иммунитета (NK-клетки и специфические цитотоксические T-лимфоциты). Постинфекционный иммунитет достаточно длителен и прочен, но высокоспецифичен.

 

Микробиологическая диагностика. Если целью диагностики является обнаружение возбудителя или его генома, то материалом для исследования служит носоглоточное отделяемое, мазки-отпечатки со слизистой оболочки носа. Возможно постмортальное исследование аутопсийного материала (кусочки пораженной легочной ткани, соскобы со слизистой оболочки бронхов и трахеи). При отборе материала важно получить пораженные вирусом клетки, так как именно в них происходит репликация вирусов, а также правильно организовать транспортировку в лабораторию для сохранения жизнеспособности инфицированных вирусом клеток. Если цель диагностики заключается в поиске вирусспецифических антител, то материалом для исследования являются парные сыворотки больного.

Экспресс-диагностика. Обнаруживают вирусные антигены в исследуемом материале с помощью РИФ (прямой и непрямой варианты) и ИФА. Можно обнаружить в носовых смывах вирусную РНК с помощью ПЦР.

Вирусологический метод. Вирусы гриппа можно выделять в курином эмбрионе, культуре клеток (например, в культуре клеток почек обезьян, почек собак-MDCK и т.п.), а также в организме лабораторных животных. Индикацию вирусов проводят в зависимости от лабораторной модели (по гибели, клиническим и патоморфологическим изменениям, цитопатическому действию, образованию бляшек, цветовой пробе, РГА и гемадсорбции). Идентифицируют вирусы по антигенной структуре. Применяют РСК, РТГА, ИФА, реакцию биологической нейтрализации вирусов и др.

Серологический метод. Диагноз подтверждают при четырехкратном увеличении титра антител в парных сыворотках от больного, полученных с интервалом 10-14 дней. Применяют РТГА, РСК, ИФА, РБН вирусов. Метод часто используют для ретроспективной диагностики.

Лечение. В большинстве случаев течение гриппа доброкаче- ственное и требует только симптоматического/патогенетическо- го лечения (применяют жаропонижающие, сосудосуживающие, антигистаминные препараты, витамины, детоксикацию, иммуномодуляторы, ангиопротекторы, ингибиторы протеолиза и т.д.). Противовирусным действием обладает α-интерферон, препараты которого применяют интраназально. Можно использовать препараты — индукторы эндогенного интерферона. Для этиотропного лечения в первые 48 ч применяют различные противовирусные химиотерапевтические препараты: ремантадин (препятствует репродукции только вирусов гриппа А, блокируя ионные каналы белка М2), арбидол — препарат, который действует на вирусы гриппа А и В, ингибиторы нейраминидазы, например озельтамивир, который связывается со стабильными (консервативными) участками нейраминидазы, одинаковыми у всех типов вирусов гриппа. При тяжелых формах гриппа, которые чаще развиваются у пациентов группы риска, можно применять также противогриппозный донорский иммуноглобулин и нормальный человеческий иммуноглобулин для внутривенного введения. Если присоединяется бактериальная инфекция, назначают антибиотики.

 

Профилактика. Для неспецифической профилактики гриппа проводят противоэпидемические мероприятия, ограничивающие распространение вирусов гриппа аэрогенно и контактно (изоляция больных, карантин в детских коллективах и лечебных учреждениях, дезинфекция белья и посуды, ношение марлевых повязок, тщательное мытье рук и т.п.). Большое значение имеет повышение общей сопротивляемости организма. Для экстренной химиопрофилактики во время эпидемии гриппа можно применять ингибиторы нейраминидазы, а также арбидол и ремантадин. Для неспецифической противовирусной профилактики используют интраназально препараты α-интерферона и оксолина.

Специфическая плановая профилактика состоит в применении вакцин. Вакцинацию проводят не менее чем за месяц до начала эпидемического сезона (сентябрь-октябрь), чтобы успел сформи-

роваться активный иммунитет. Вакцинирование рекомендовано прежде всего детям, лицам из группы высокого риска, персоналу лечебных учреждений и т.п. Разработано несколько разновидностей вакцин для профилактики гриппа А и В, приготовленных на основе штаммов, прогностически актуальных в данный эпидемический сезон. Вакцинные штаммы обновляются раз в 2-3 года. Для поддержания напряженного иммунитета требуется ежегодная ревакцинация, однако следует помнить, что имеются противопоказания. В настоящее время в России для профилактики гриппа разрешены к применению живые аллантоисные вакцины (интраназальная и подкожная), инактивированные цельновирионные вакцины (интраназальная и парентеральная подкожная), химические (в том числе полимерсубъединичная) и сплит-вакцины. Живые вакцины создают наиболее полноценный, в том числе местный, иммунитет. Однако они и инактивированные цельновирионные или убитые вакцины могут вызывать аллергию у лиц с повышенной чувствительностью к куриному белку. Сплит-вакцины, т.е. так называемые расщепленные, содержат полный набор вирусных антигенов, но из них удалены липиды внешней оболочки, чтобы уменьшить пирогенный эффект. Субвирионные или химические вакцины содержат только протективные антигены — гемагглютинин и нейраминидазу.

�т�….. ..�} �v} �тря на вирусемию, больной человек является «тупиком» для вируса, так как не может быть донором для клещей.

Различают три клинические формы клещевого энцефалита: лихорадочную, менингеальную и очаговую, которая протекает наи- более тяжело и сопровождается развитием параличей шеи и верхних конечностей.

Иммунитет. После перенесенного заболевания остается стойкий иммунитет. ВКЭ относится к факультативным возбудителям медленных вирусных инфекций. В ряде случаев у 2-12% больных отмечается прогредиентное течение заболевания (от лат. gradatio — постепенное усиление, неуклонное прогрессирование) с переходом в хроническую форму на фоне активного антителообразования. Персистирующий ВКЭ меняет свои свойства. Он не экспрессирует антигены на поверхности клеток и не оказывает цитопатического действия.

 

Лабораторная диагностика клещевого энцефалита основана на обнаружении вируса и его антигенов в исследуемом материале, постановке ПЦР, а также обнаружении антител. Вирус выделяют из крови и цереброспинальной жидкости больных, а также внутренних органов и мозга умерших путем интрацеребрального заражения новорожденных белых мышей и культур клеток. Идентификацию вируса проводят в РТГА, РН и РСК, а в монослое культур клеток в РИФ. Обнаружение антител в парных сыворотках и цереброспинальной жидкости проводят с помощью РСК и РТГА. Для обнаружения специфических IgM и IgG к белку E ВКЭ применяют ИФА. Разработана лантанидная иммунофлюоресцентная система для выявления специфических антител классов M и G, а также антигенов ВКЭ. Обнаружение антигенов в исследуемом материале, в том числе в клещах, снятых с укушенных людей, проводят с помощью ИФА-Е. Экспресс-диагностика клещевого энцефалита основана на обнаружении вирусного антигена в крови с помощью РНГА и ИФА, выявлении IgM-антител на первой неделе заболевания в цереброспинальной жидкости и обнаружении РНК

вируса с помощью ПЦР в крови и цереброспинальной жидкости у людей.

Специфическое лечение и профилактика. Для лечения и экстренной профилактики клещевого энцефалита применяют специфический гомологичный донорский иммуноглобулин против клещевого энцефалита. При отсутствии данного препарата назначают специ- фический гетерологичный лошадиный иммуноглобулин. При невозможности введения иммуноглобулина используют индуктор интерферона (йодантипирин). Серотерапию необходимо начинать не позднее 3-4-го дня заболевания. Для вакцинации лиц, проживающих на эндемичных по клещевому энцефалиту территориях, а также выезжающих на эти территории в весенне-летний период используют убитые культуральные вакцины.

 

Для исключения пищевого пути заражения в природных очагах клещевого энцефалита необходимо потреблять только кипяченое молоко.

Источник: www.sites.google.com

The Evolutionary Pattern of Glycosylation Sites in Influenza Virus (H5N1) Hemagglutinin and Neuraminidase
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3486865/

Конкурирующие интересы: авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Задуманные и разработанные эксперименты: WC YZ SS. Выполнял эксперименты: WC YZ. Проанализированы данные: WC YZ YQ ZL. Добавленные реагенты / материалы / инструменты анализа: WC SS ZL. Написал бумагу: WC YQ ZL. Разработанная программа, используемая в анализе: WC ZL.

Два гликопротеина, гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (NA) на поверхности вирусов гриппа играют решающую роль в трансфаунизации, мембранном слиянии и высвобождении вирионов потомства. Чтобы исследовать распределение сайтов N-гликозилирования (гликозитов) в этих двух гликопротеинах, мы собрали и выровняли аминокислотные последовательности всех подтипов HA и NA. Два гликозита были расположены на сайтах расщепления HA0 и слитых пептидах и были поразительно сохранены во всех подтипах HA, в то время как остальные гликозиты были уникальны по своим подтипам. В домене стебля NA обнаружены два-четыре консервативных гликозита, но на них влияет удаление определенных последовательностей доменов стебля. Другой высококонсервативный гликозит появился в верхнем центре тетрамерного глобального домена, в то время как другие гликозиты были распределены по всему глобальному домену. Здесь мы подробно рассмотрим распределение и эволюционную структуру гликозитов в гликопротеинах оболочки IVs и далее сосредоточимся на вирусе H5N1 и пришли к выводу, что гликозиты в H5N1 усложнились в НА и менее влиятельны в NA в последние пять лет.

Вирусы гриппа A (IVs), принадлежащие к семейству ортомоксивирид, состоят из восьми отрицательных РНК-нитей. Гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (NA) представляют собой два гликопротеина, которые кодируются геном IV, выраженные из сегментов 4 и 6 соответственно. Выбор из-за различных иммунных систем хозяина и анти-гриппа ускоряет скорость мутаций вирусных белков, особенно для этих двух мембранных белков [1], [2]. Существует 17 подтипов HA и 10 подтипов NA, обозначенных H1-H17 и N1-N10, соответственно. Более 118 комбинаций IV могут быть выделены из диких птиц, которые также являются естественным резервуаром этих вирусов (за исключением вируса H17N10, который до недавнего времени был изолирован только от летучей мыши) [3] — [5]. Способность к прыжку видов IV может привести к заражению птицы и млекопитающих, таких как курица, свиньи, лошади или киты, с различными уровнями вирулентности [6] — [9]. Вирусы H1N1, H2N2 и H3N2 ответственны за десятки миллионов смертей во время смертельной истории эпидемий гриппа человека. Кроме того, вирусы H5N1, H7N7, H7N2, H7N3 и H9N2 были выделены из спорадических человеческих инфекций и смертей [10] — [13]. Стоит отметить, что вирус H5N1 является наиболее тяжелым для человека и птиц, с внезапным началом и высокой смертностью. Уровень смертности у сотен пациентов, госпитализированных для инфицирования H5N1, составил примерно 59,05%, что намного выше, чем смертность от испанского гриппа или пандемии гриппа 2009 года (H1N1) [11], [14], [15].

В качестве требования к инфекции гомотримерные HA играют ключевую роль в связывании с рецепторами рецептора сиаловой кислоты (SA) и слиянием мембран. Зарождающаяся НА всех подтипов состоит из консервативных структур, включая сигнальный пептид, домен цитоплазмы, трансмембранный домен и внеклеточный домен [16]. Зрелый HA-мономер может быть расщеплен протеазами в глобальные субъединицы HA1 и стебля HA2 [17]. Когда IVs расположены в пищеварительном тракте хозяина или клетке дыхательных путей, рецептор-связывающие домены (RBD) на кончике HA1 связываются с рецепторами SAα2-3Gal или SAα2-6Gal, которые необходимы для эндоцитоза [18], [19] , HA разворачивают и выставляют внутренние субъединицы HA2 в кислотной среде, затем слитые пептиды в HA2 входят в мембрану хозяина (слияние вирусных мембран) [20], [21].

Гомотетрамерный NA является мембранным белком типа II, тогда как HA является мембранным белком типа I. Зарождающийся NA состоит из четырех частей: хвоста цитоплазмы (в аминоконце), трансмембранного домена, домена стебля и глобальной области [22]. Различные подтипы NA состоят из 450-480 аминокислот, демонстрируя низкую последовательность сходства. Хотя существуют различные гомологии среди различных подтипов NA, особенно в подтипах N1 и N2 с делецией 4 ~ 30 аминокислот в стеблевой области [23], подтипы NA демонстрируют стабильные топологии: шестилопастное β-пропеллерное сложение делает домен ферментативной активности, который функционирует в высвобождении вирионов потомства [24], [25].

Филогенетические деревья HA и NA были построены с использованием трех-десяти типичных аминокислотных последовательностей в каждом подтипе (файл S1). Распределенные диаграммы гликозитов, окрашенные по статистике сохранения в каждом подтипе НА или NA (файл S2), показаны в разных полосах. Красный, зеленый и синий цвета представляют уровни сохранения «> 95%», «5% ~95%» и «<5%» соответственно. Сохраненные цистеины показаны желтыми полосками. (A) N-J-дерево подтипов НА с соответствующей схемой распределения гликозитов. (B) Дерево N-J подтипов NA с соответствующей схемой распределения гликозитов.

HA и NA имеют коэффициент распределения 4:1 на оболочке вируса гриппа и сохраняют основные функции распознавания, инфекции и вирусной диффузии у хозяина [26]. В различных исследованиях сообщалось, что некоторые из факторов, влияющих на НА, включают количество основных остатков в сайте расщепления HA0, мутацию ключевых остатков в RBD, изменение антигенных сайтов или сайтов N-гликозилирования (гликозитов) и вариацию топологии структур N-гликанов [15], [27]. Между тем, факторы, которые влияют на НС, включают в себя делецию доменов стебля, резистентность к мутациям, а также изменение сайтов антигена или гликозитов и изменение топологии структур N-гликанов [28]. Как своего рода глюкансвязывающий белок (GBP), HA работает с NA, который функционирует как экзогликозидаза, совместно. Только путем достижения динамического равновесия между прикреплением к хозяину и высвобождением вирионов потомства IV могут получить долгосрочный механизм заражения и диффузии.

(A) Большинство соседних гликозитов в одной области были определены антигенным дрейфом по сравнению с фракцией близлежащих гликозитов, которые были вызваны сдвигом антигена. Хотя гликозиты 144NVT / 142NHT распространены в сезонных вирусах H1N1, они имеют различное происхождение. Гликозиты 177NLS / 179NKS были еще одной распространенной особенностью вируса H1N1. Очевидно, что сезонные IV с длительным кровообращением имели больше гликозитов, чем птичий грипп или пандемический грипп. (B) Схема удаления доменов стебля в N2 NA отличается в разных комбинациях IV. Репрезентативные последовательности NA в каждом доступном подтипе N2 выровнены в домене стебля. Как можно заметить, количество делеций варьирует от 4 до 24 остатков, что приводит к потере одного или двух потенциальных гликозитов. Среди них появился новый гликозит в реструктурированном NA вируса птичьего H2N2.

Существование N-гликозилирования необходимо для гликопротеинов вирусных мембран. Биосинтез и модификация возникающих секреторных или мембранных белков происходят в эндоплазматическом ретикулуме, а Golgi, N-связанные гликаны кодируют важную информацию для сгибания, созревания, транспорта или деградации белков [29]. Чтобы избежать гуморальной и клеточной иммунной системы хозяина, потенциальные гликозиты в белках вирусной оболочки могут обеспечить идентичные гликаны, как и клетки хозяина, для маскирования антигенных сайтов [28], [30]. Кроме того, гликозилирование также влияет на чувствительность НА к температуре, защиту участков расщепления и доменов стебля и даже рецептор-связывающие предпочтения [31] — [33]. В качестве идеальной модели влияния N-гликозилирования при взаимодействии патоген-хозяин настоящие исследования показывают, что огибающие гликопротеины IVs, по-видимому, имеют только N-гликозилирование без O-гликозилирования и GPI-якорей [34]; следовательно, гликозиты, обсуждаемые в этой статье, относятся только к сайту N-гликозилирования.

Статистический анализ в HA и NA показал, что гликозиты в H5N1 усложнились в НА и менее влиятельны в NA за последние пять лет. Все последовательности HA и NA содержались в файлах S3 и S4. Как показано, записи в 1957-1996, 1998-1999 и 2012 годах были настолько ограниченными, что их следует объединять или исключать. (A) Число записей HA и NA в последние годы. Самая большая запись вируса H5N1 впервые появилась в 1957 году и быстро увеличилась после 2004 года. (B) Процент различных клад или субкладов с 1957 по 2011 год. Ранние вирусы H5N1 принадлежали к кладе 0 и диверсифицировались после 2002 года. Наиболее распространенные клады 2.2 и 2.3 стала доминирующей после 2008 года. (C) Кумулятивный процент неконсервированных гликозитов в HA. Эволюция шести неконсервативных гликозитов показала, что разнообразие N-гликозилирования стало распространенным после 2007 года. (D) Кумулятивный процент неконсервированных гликозитов в NA. Эволюция четырех консервативных гликозитов в домене стебля и пяти неконсервативных гликозитах показала, что частота и разнообразие быстро падают после 2007 года.

В современных исследованиях была проанализирована эволюционная динамика сайтов N-гликозилирования подтипов подтипа или ГА / НА в целом [35] — [37]. Хотя большинство эволюции гриппа можно объяснить генетическим дрейфом, есть также свидетельства адаптивной эволюции мутаций, которые находятся под позитивным отбором [38], [39]. Мы продолжили предыдущие исследования по основному подсчету подобия сходства для анализа позиционно-специфических гликозитов, находящихся под избирательным давлением в IVs [40]. Здесь мы приводим подробное исследование распределения и эволюционной картины гликозитов в гликопротеинах оболочки IV, особенно в вирусе H5N1.

В левом верхнем углу показана схема различных гликозитов в HA и NA. Зеленые и красные скрещивания представляют собой HA и NA соответственно, а слегка окрашенная область в NA является доменом стебля. Пренебрежимые и высококонсервативные гликозиты показаны в красной полосе, а остальные — в голубом тексте. Все клады первого, второго, третьего и четвертого порядка показаны с синими, зелеными, оранжевыми и малиновыми стрелами соответственно.

Аминокислотные последовательности HA и NA были получены из NCBI (National Center for Biotechnology Information) Influenza Resource (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU, доступ к которому был получен 15 марта 2012 г.) [5]. Чтобы полностью понять распределенную закономерность гликозитов в каждом подтипе, мы скачали 29 наборов HA и NA с индивидуальным определением «> {серотип} {штамм} {segname}», используя следующие комбинации: H1Nx~H17Nx и HyN1~HyN10 (где x и y представляют «любые» по умолчанию), в дополнение к HA и NA от вируса H5N1.

Наиболее консервативные гликозиты (> 95%) показаны в красных сферах, а остальные — в циановых сферах. (A) Вид снизу глобальной области мономера NA. (B) Вид сбоку мономера NA, удаление домена стебля будет уменьшать четыре гликозита. (C) Вид сверху тетрамера NA. (D) Вид сбоку глобального домена в HA-мономере. (E) Вид сбоку домена стебля в HA-мономере, гликозите 559NGS в домене слитого пептида не может быть замечен из-за ограниченных данных. (F) Вид сбоку тримера HA.

Все выравнивания последовательностей различных HA и NA были выполнены с использованием Clustal 2.0. Были удалены повторяющиеся, неполные и смешанные последовательности. Для удобства была выбрана одна репрезентативная последовательность с наиболее длинной длиной от каждого подтипа для дальнейшего описания (таблица S1 и S2).

(A) Вирусы с гликозилированным и негликозилированным 170N и 181N, которые являются ключевыми гликозитами в H5N1 HA, сосуществовали еще до 1997 года. Ближайшими гликозитами, вызванными «антигенным дрейфом», были «179NYT / 181NNT». Консервированный гликозит 181NNT был заменен 179NYT на части вирусов clade 7 с 2005 года (36 записей в наборе H5). Большинство вирусов в кладе 2.2 и кладе 2.3.2 отображали дефицит 158N гликозита, в то время как clade 1.1 и clade 2.3.4 демонстрировали сохранение 158N гликозита. (B) Удаление домена стебля в NA считалось характеристикой HPAI. Фактически, вирусы с отсутствующим и полным доменом стебля сосуществовали еще до 1997 года. Шаблоны удаления домена стека имеют две стадии с разницей в 50NQS.

Чтобы оценить взаимосвязь между распределенной регулярностью гликозитов в гликопротеинах оболочки и эволюционным положением различных HA и NA, во-первых, предварительные деревья для каждого подтипа HA и NA были построены с использованием всех доступных последовательностей; во-вторых, были отобраны десять репрезентативных последовательностей из разрозненных кладов с учетом источника и зон хозяина (исключая H14, H17 и N10 из-за ограниченных записей). Наконец, филогенетические деревья HA и NA были построены этими сотнями последовательностей (файл S1). Филогенетические деревья HA и NA были построены MEGA5.05 с использованием методов N-J и модель p-distance с величиной бутстрапа 1000 [41], [42].

Звездочка представляет собой те сайты, которые были вычислены только в полном домене.

Как известно, N-X-T / S (X не может быть пролиной) является гликозитовым мотивом. Хотя некоторые исследователи пришли к выводу, что не все потенциальные гликозиты будут гликозилированы у зрелых гликопротеинов, Kelley WM et al. утверждал, что глюканы с 14 сахарами будут перенесены на все гликозиты в зарождающихся белках и будут усечены и модифицированы в последующем процессе [42].

Из-за фиксированной картины гликозита многие программы и программное обеспечение обеспечивают предсказание гликозитов [43], таких как «NetNGlyc 1.0 Server» (www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc). Отправляя файлы выравнивания на сервер прогнозирования, мы получили ряд оценок для потенциальных гликозитов. Принимая во внимание ошибку эксперимента, эти случайные гликозиты, которые могут возникнуть в результате геномного секвенирования или переведены различными генетическими кодами, были исключены. Например, 429NLS в HA A / duck / Hunan / 3315/2006 (H5N1) появляется только в H5, установленном один раз, и он также встроен внутри тримера HA [44]. Статистические данные о позиции, структуре и уровнях сохранения в разных подтипах использовались для дальнейшего обсуждения (таблица S1, файл S2).

Доступные структуры HA и NA помогут нам исследовать отличительную функцию различных гликозитов. Поэтому мы собрали структуры различных подтипов HA или NA из PDB (Bank Data Protein, http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do). Чтобы получить весь мультимер, эти мономерные структуры обрабатывались матрицей преобразования VMD 1.9 с использованием сценария Tcl [45]. Код для каждой репрезентативной структуры различных подтипов HA и NA и соответствующего источника IV представлен в таблице S2.

Большинство файлов координат гликопротеинов оболочки получены из рентгеновской кристаллографии или ЯМР. Кроме того, полные большие гликаны слишком гибкие, чтобы обеспечить достаточную плотность электронов [46]. Выделение и очистка мембранных гликопротеинов с помощью конкретных обработок ферментами приводит к отсутствию частичных доменов [47]. Таким образом, полные структуры недоступны. В большинстве зарегистрированных структур HAs отсутствует участок расщепления HA0 и частичный HA2; в то время как у НС не хватает стволовых доменов.

Вирус H5N1 можно разделить на 10 кладов в соответствии с эволюционным положением HA, определенным ВОЗ (Всемирной организацией здравоохранения) в 2008 году. Эти клады пронумерованы от 0 до 9 [48], [49]. Clades 0-2 отвечают за все человеческие инфекции, что приводит к 359 смертельным исходам с 2003 года [11]. За последние четыре года многие клады не сообщались, а доминирующие вирусы H5N1 сосредоточены в кладе 0 ~ 2. Clade 2.1, clade 2.2 и clade 2.3 дополнительно эволюционировали в клады третьего или четвертого порядка, и эти вновь образованные вирусы стали географическими штаммами.

С целью изучения взаимосвязи эволюции гликозитов HA и NA мы реконструировали дерево филогении HA и определили десять клад. Когда дискретные монофилетические группы с общим узлом соответствуют значению начальной загрузки ≥60 в определяющем кладу узле и средним процентным попарно нуклеотидным расстоянием между и внутри кладов> 1,5% и <1,5%, соответственно, они могут разделиться на второй, третьего или даже четвертого порядка [50]. Статистика гликозитов каждого НА, а также соответствующего НС регистрировалась в соответствии с их кладами (файлы S3, S4 и рис. S1).

Как показано на фиг. 1А, текущие 17 HA-подтипы были сконцентрированы в двух эволюционных группах. Одна большая группа, представленная H1 и H5, содержала H2, H6, H8, H9, H11, H12, H13 и H16; Другая большая группа была представлена ​​H3 и содержала H4, H7, H10, H14 и H15. Хотя каждый подтип НА имел более низкое сходство друг с другом, а распределение гликозитов различалось в последовательной нумерации, мы обнаружили, что выравнивание последовательности всех подтипов НА указывает на то, что частичные гликозиты появились в подобных областях. Кроме того, выравнивание структуры доступных HA также показало, что различные HA-подтипы имеют высококонсервативную структуру, а распределение гликозитов также является регулярным (рис. S2).

Анализируя положение гликозитов и их консервативные показатели, мы заключаем, что в HAs появляются два типа гликозитов: один с высоким уровнем консервации во всех подтипах HA, а другой с различными консервативными показателями в разных подтипах HA. Два высококонсервативных гликозита расположены вблизи участка расщепления HA0 (например, 27NNST в H1 или 30NGT в H8) и слитого пептида HA2 (например, 498NGT в H1 или 500NGS в H5) соответственно во всех подтипах, и эти два гликозита играют необходимую роль в жизненном цикле вируса для защиты сайтов расщепления HA0 и слитого пептида [34], [51]. Кроме того, еще один высококонсервативный гликозит появляется в С-концевой части последовательности HA1, которая находится вблизи соединения глобальных и стеблевых доменов, за исключением последовательностей H7 и H15 [52]. От 3 до 10 характерных гликозитов были отличительными в каждом подтипе. На их консервативные показатели влияли различные ветви внутренней эволюции, которые оценивались с 0,5% (например, 292NGS с 2,85% в H3) до 100% (например, 38NGT с 99,94% в H3), распределенных главным образом в глобальном домене. Стоит отметить, что некоторые высококонсервативные гликозиты были близки к цистеинам (рис. 1). Козлов и др. предположил, что ERp53, который участвует в образовании дисульфидных связей при сгибании зарождающихся белков, образует комплекс с кальретинулином / кальнексином, который зависит от предшественников N-гликанов [53].

Одна из наиболее очевидных характеристик гликозитов заключалась в том, что увеличение количества образцов или кросс-видов отчетов приведет к увеличению количества гликозитов. Существует множество факторов, способствующих существованию многочисленных гликозитов в подтипах H1, H3 и H5. Поскольку вирус РНК быстро мутирует, долгосрочные межвидовые инфекции привели к накоплению адаптивных мутаций и гликозитов. Из-за давления отбора различных иммунных систем хозяина, невыгодная мутация будет устранена, в то время как вирус с приростом и потерями гликозитов будет сохранен. Например, HA из вируса птичьего вируса H1N1 или H3N2 имели меньше гликозитов, чем у сезонного человеческого вируса H1N1 или H3N2 (например, 286NAS в A / Memphis / 28/1983 (H1N1). Рисунок 2A и File 5S).

Набор H3 имел большинство гликозитов (16, как показано в файле S6) среди всех подтипов HA, которые в основном были связаны с вирусами H3N2 и H3N8. Самая ранняя запись H3 имела только один умеренный консервативный гликозит (79NCT, например A / equine / Miami / 1/1963 (H3N8)), за исключением шести высококонсервативных гликозитов, который также сохраняется в большинстве сезонных вирусов H3N2 человека и вируса H3N8 млекопитающих (например, A / Denmark / 22/2011 (H3N2) или A / equine / Yokohama / aq79 / 2011 (H3N8)), но не в последующем птичьем вирусе H3N1~ H3N9 (например, A / duck / Zhejiang / 5/2011 (H3N3) или A / duck / Saitama / 2/2009 (H3N8). Файл S5). В течение последних четырех десятилетий сезонные вирусы H3N2 человека постепенно приобретали дополнительные гликозиты в глобулярном HA1 [37], [40]. Возникновение 294NSS увеличило количество гликозитов до 13 в частях текущей HA вируса H3N2 с 2010 года (A / Singapore / GP5 / 2011 (H3N2). Файл S6).

Не все гликозиты использовали одну и ту же нумерацию в одном подтипе. По этой причине мы выбрали репрезентативную последовательность для каждого подтипа (таблица S1). На большинство гликозитов влияли делеция или вставка мутантов в восходящую последовательность, которая также известна как «антигенный дрейф» [54]. В HA вирусов H1N1 или H5N1 некоторые близлежащие гликозиты определялись «антигенным сдвигом» [55]. В подтипах H1 гликозит 144NVT из сезонного гриппа H1N1, который был выделен с 1940-1980-х годов (например, A / Memphis / 1/1984 (H1N1)), был заменен 142NHT-гликозитом после 1990-х годов (например, A / California / 04/2007 (H1N1)). Кроме того, такое гликозилирование не появилось в тех вирусах H1N1, выделенных из свиного гриппа H1N1 (например, A / swine / Guangdong / 1604/2010 (H1N1)), испанский грипп (например, A / South Carolina / 1/1918 (H1N1)) и пандемия гриппа 2009 года (H1N1) (например, A / Mexico city / CIA1 / 2009 (H1N1)). Было частично показано, что вакцинация мышей штаммом гриппа 1918 года, защищенная от последующей летальной инфекции вирусом 2009 года; однако штамм 1918 года не защищал от сезонного гриппа H1N1 [56]. Интересно отметить, что миграция 179NKS на 177NLS треков с этими эффектами. Почти все идентифицированные гликозиты 179NKS были централизованы вирусами гриппа свиного происхождения (S-OIVs, например A / Swine / Guandong / 1604/2010 (H1N1)) и частями вируса гриппа H1N1, вызванного вирусом гриппа 2009 года (например, A / Mexico Город / 014/2009 (H1N1)), в то время как гликозит 177NLS в основном был обнаружен у свиней или человеческих вирусов H1N2 (например, A / New York / 481/2003 (H1N2)) и большинства сезонных вирусов гриппа (например, A / California / 04/2007 (H1N1)). Эти даты далее подтверждают, что HA пандемии гриппа 2009 года (H1N1) происходит от S-OIV, а не до предыдущего сезонного вируса [57]. Аналогичная позиционная конверсия гликозитов в H5N1, вызванная «антигенным дрейфом», была «179NYT / 181NNT». Консервированные гликозиты 181NNT были заменены 179NYT на части вирусов clade 7 с 2005 года. Это напоминает нам, что хотя эти гликозиты были соседними, их N-гликаны защищали бы различные антигенные сайты, что обеспечило бы некоторые предложения по разработке вакцины против гриппа ,

Более того, в меньшем кластере H7, H10 и H15 один высококонсервативный гликозит появился в длинной a-спирали HA2 (например, 431NWT в A / turkey / Chile / 4418/02 (H7N3)). Этот необычный гликозит требует дальнейшего изучения (файл S1).

Из рисунка 1B видно, что N10 сильно отличается от других подтипов [4]. Остальная часть текущего 9 подтипов NA сосредоточена в две эволюционные группы: одна группа была представлена ​​N2 и содержит N3, N6, N7 и N9; а другая группа содержит N1, N4, N5 и N8.

Гликозиты NA можно разделить на два типа в соответствии с распределенной областью: два-четыре высококонсервативных гликозита расположены в домене стебля в каждом подтипе; два консервативных гликозита и большинство средне-низких консервативных гликозитов в основном расположены в глобальной области, которые находятся вблизи верхушки NA, соединения глобальных и стеблевых доменов или антигенных сайтов. Гликозит 146N является консервативным во всех подтипах NA (например, 146NDT в A / Boston / 20/2008 (H3N2), 144NGT в A / duck / Taiwan / 4201/99 (H7N7) или 146NGT in / Viet Nam / 1203/2004 (H5N1)). Было показано, что N-гликан при этом гликозите влияет на ферментативную активность NA, что приводит к 20-кратному снижению активности [58]. Подобно описанию HA, большое количество вирусов H1N1, H3N2, H5N1, H7N2 и H9N2 накопили многочисленные гликозиты в N1 и N2, особенно в глобальной области, в основном участвуя в иммунном уклоне. Более того, один консервативный гликозит 12NTT (Консервативная скорость: 93%, например A / turkey / Italy / 3807/2004 (H7N3)), расположенная в трансмембранном домене в N3 и N10, требует дальнейшего изучения [59].

Значение консервативных гликозитов в домене стебля обеспечивало N-гликаны, чтобы избежать расщепления ферментом хозяина (например, трипсином) [60], [61]. Дисперсия гликозитов была тесно связана с делецией доменов стебля. Хотя трехмерная структура доменов стебля еще не определена, предполагается, что наличие моста α-спирали в некристаллизованной структуре также обеспечивается криоэлектронной микроскопией [62]. Вагнер и др. считал, что более длинный домен ствола увеличит способность к репликации вируса, в то время как удаление стволового домена уменьшит ферментативную активность NA [63]. Различные подтипы имели делеции доменов стебля от 3 до 24 остатков, за исключением N4, N8, N9 и N10.

Число удалений также было характерно для разных комбинаций IV и даже внутри одного подтипа, такого как подтип N2. Как правило, никакие делеции не были обнаружены в NA вируса H3N2; делеция 3 остатков и одного соответствующего гликозита с образцом «ER-61N-3-64T-VH» (что означает, что 3 остатка, отсутствующие между 61N и 64T, например, A / chicken / Zhejiang / 611/2011 (H9N2)), появились в большинство подтипов NA вируса H9N2. Аналогичная делеция 20 остатков и двух гликозитов (I-E-60R-20-80N-I-I) проявлялась в большинстве подтипов NA вируса H6N2 (например, A / duck / Fujian / 3193/2005 (H6N2)). Выделение 16 остатков и двух гликозитов как «C-E-55P-16-72T-T-E» было отличительной частью вируса H7N2 (например, A / unknown / New York / 19501-5 / 2006 (H7N2)). Части вируса H5N2 характеризовались делецией 20 остатков и двух гликозитов («R-N-62I-20-83G-Y-R», например, A / chicken / Ibaraki / 3/2005 (H5N2)). Более того, в некоторых птичьего вируса H2N2 делеция 22 остатков приводила к потере двух гликозитов; однако новый новый гликозит появился во вновь созданных последовательностях («P-A-47N-22-70N-T-V», например, A / chicken / New York / Sg-00300/1997 (H2N2)). В целом, разнообразие делеций в домене стебля указывает на то, что структура гликозилирования HA и NA имеет сложную взаимосвязь.

В глобальном масштабе исследователи обращают внимание на высокопатогенный грипп птиц (HPAI) с момента первой человеческой смерти, вызванной непосредственно вирусом птичьего вируса H5N1 в 1997 году. Обычно считается, что вирусы HPAI характеризуются многоосновными остатками в сайте расщепления HA0 в HA и удаление домена стебля в NA [64]. Однако эти характеристики были представлены даже до 1990-х годов. Самый ранний вирус H5N1, «A / chicken / Scotland / 1959 (H5N1)», имел четыре постоянных основных остатка в участке расщепления HA0 (по сравнению с 5-6 непрерывными основными остатками в большинстве распространенных H5N1 HAs); преследуемая делеция NA также существовала в A / Turkey / Ontario / 84/1983 (H5N1). Записи вируса H5N1 быстро увеличивались с 2003 года. С тех пор появилось несколько новых клад и субкладов, в результате чего появились новые новые гликозиты (рис. 3A и 3B). Процент неконсервированных гликозитов в HA также увеличивался и диверсифицировался быстро после 2003 года, между тем процент неконсервированных гликозитов в NA постепенно снижался, независимо от тех высококонсервативных гликозитов (рис. 3C и 3D).

Оба двенадцати гликозита были обнаружены в HA и NA вируса H5N1, показанные в таблицах 1 и 2 и в файлах S3 и S4.

Большинство вирусов H5N1 были сгруппированы в кладу 0 до того, как он появился в Гонконге снова в 2003 году. Различные типы гликозитов в HA и NA сосуществовали в этих оригинальных вирусах. Эти оригинальные НС содержали известные гликозиты, включая четыре высококонсервативных гликозита в домене стебля и семь в глобальном домене (за исключением случайного 341NGT, который появился только в документах clade 1 и Thailand за 2004-2010 гг., Например, A / chicken / Thailand / CU-354/2008 (H5N1)). Напротив, шесть высококонсервативных гликозитов вместе с 170NST широко распространены в кладе 0. С 2003 года ВОЗ зарегистрировала трехволновую эпидемию H5N1, которая привела к сотням смертей и огромным экономическим потерям [11]. До недавнего времени гликозитовые структуры были высококонсервативными во всех птичьих кладах, за исключением клады 7 (например, клады 3, 4, 5, 6, 8 и 9), как показано на рисунке 4 и рисунке S2.

Большинство зарегистрированных в настоящее время вирусов H5N1 были сконцентрированы в кладах четвертого порядка. В течение этого десятилетия увеличились человеческие инфекции и новые гликозитовые структуры HA и NA. Сообщалось, что вирус H5N1 клады 2.2 был вовлечен в вспышку, которая произошла среди популяции мигрирующих птиц вблизи озера Цинхай в 2005 году. С тех пор клада 2.2 распространилась на запад. Это привело к гибели диких птиц в Европе [65]. В 2006 году вирус H5N1 появился впервые в Африке, а затем сотни смертоносных людей в Египте, Нигерии и Джибути [66]. Самый последний вирус H5N1, выделенный из Северной Африки, относится к кладе 2.2.1.1 вместе с одним новым гликозитом 88NVS. Кроме того, большинство вирусов в кладе 2.2, за исключением клады 2.2.1.1, не имеют 170N гликозита, созданного мутацией T172A. Wang et al. пришли к выводу, что отсутствие 170NST будет способствовать сближению HA для SA-рецепторов, особенно к сиалогликанам SAα2-6Gal, что может быть одной из причин склонности кланы 2.2.1 к инфицированию людей [67] по сравнению с тремя консервативными гликозитами в NA клады 2.2.1.1 (Рисунок 4, Файлы S3).

Части вируса H5N1, выделенные из Китая и Вьетнама, относятся к кладе 2.3.4, с сохраненными гликозитами в HA, но не в NA. Напротив, другой доминирующий вирус из кладе 2.3.2 показал потерю 170NST в НА и стабильных гликозитах в NA. В рамках нынешней кланы 2.3.2.1 появился новый гликозит «156NSS», который сосуществует с 88NVS вблизи сайтов антигенов (рис. 5D, «Файлы S3»).

Гликозит 181NVT, который расположен в апикальном β-свертывании НА, сохраняется во всех человеческих IV (например, A / Anhui / 1/2007 (H5N1)). Предыдущие статистические данные показали, что этот гликозит имеет более низкий уровень сохранения в птичьих IV (например, A / chicken / Vietnam / NCVD-093/2008 (H5N1)). Результаты моделирования молекулярной динамики показали, что α2-3-сиалогликаны использовали прямую и внешнюю топологическую структуру, в то время как α2-6-сиалогликаны были похожими на крючки и внутрь; поэтому мы пришли к выводу, что дефицит гликозита принесет пользу связыванию сиалогликанов SAα2-3Gal [68]. Фактически, все вирусы, у которых были дефициты гликозита 181N, были выделены из птичьего хозяина, которые были сосредоточены в кладах 7.1, 7.2 и 2.2.1.1 (фиг. 6A, Файлы S3).

Интересно, что делеция доменов стебля в H5N1 NA является переменной. По данным первой человеческой смерти, зарегистрированной в 1997 году, большинство вирусов H5N1, принадлежавших кладе 0 и выделенных в Гонконге, характеризовались «N-Q-S-I-54I-18-73N-F-Y», который оставался гликозитом: 50NQS. Хотя в предыдущих исследованиях предполагалось, что вирус H6N1 (например, A / Teal / Hong Kong / W312 / 97 (H6N1)) является донором гена NA в 1997 году вирусом HPAI [69], [70]; однако аналогичный мотив можно было найти даже в 1983 году. С 2000 года наиболее распространенная картина «A-E-48P-20-69I-S-N» с четырьмя отсутствующими гликозитами доминировала в NAN H5N1 (рисунок 6B, файл S4).

Существует один вид гликопротеина, который участвует в распознавании и слиянии мембран в большинстве вирусных оболочек, таких как белок шипа (S) в вирусе SARS, gp160 в ВИЧ и HA в IVs [71], [72]. Эти гликопротеины могут связываться с одной специфической структурой гликанов, которая известна как лектин или фунт. Другие вирусные гликопротеины, такие как HN в вирусе болезни Ньюкасла или NA в IVs, функционируют как экзогликозидаза при высвобождении вирусных частиц [73].

IV имеют врожденную способность к высокой скорости мутаций, потому что они являются РНК-вирусами. Люди подвергаются постоянным атакам вновь возникающих IV, которые постоянно подвергаются «антигенному дрейфу» и «антигенному сдвигу». Накопление существенных последовательностей и трехмерных координат белков IV послужило идеальным инструментом для исследования того, как мутации влияют на трансфаутацию, дизайн вакцины и лекарственную устойчивость [74], [75].

N-гликозилирование влияет не только на складывание и секрецию гликопротеинов, таких как HA и NA, но также дает те же самые гликаны (аналогичные собственным гликанам хозяина), чтобы избежать иммунной системы хозяина. В качестве ключевой модификации биологического значения в вирусных гликопротеинах мы обнаружили гликозиты в 17 известных подтипах HA и 10 известных подтипах NA, которые имеют сложные характеристики. В общем, два высококонсервативных гликозита вблизи участка расщепления HA0 и сайта слияния пептида могут поддерживать основную функцию НА; эти сайты редко отсутствовали в подтипах НА. Более гликозиты были идентифицированы в глобальном домене или в связи с глобальными и стеблевыми доменами наряду с долгосрочными и крупномасштабными эпидемиями в нескольких подтипах. Регулярность распределения гликозитов в подтипах NA также сложна; два-четыре гликозита, расположенные в домене стебля, очень сохраняются в разных подтипах и подвержены удалению доменов стебля. Другой высококонсервативный гликозит был обнаружен на кончике тетрамера NA во всех подтипах. Было обнаружено, что другие гликозиты в основном концентрируются в глобальной области, которая окружает антигенные участки.

Подтипы HA или NA проявляли низкое сходство аминокислотных последовательностей во всех подтипах при сохранении идентичных структур, что показало, что функции различных подтипов HA или NA сохраняются. Примечательно, что некоторые гликозиты вблизи цистеинов также были сохранены. Цистеины играют основную роль в стабилизации третичной структуры; сохранение подтверждает, что цистеины и N-гликаны играют важную роль в сгибании и контроле качества белка.

Мы дополнительно исследовали вирус H5N1 для разработки совместных отношений гликозитов в HA и NA. Пять высококонсервативных гликозитов в НА существовали до того, как вирус H5N1 впервые пересек видовые барьеры и инфицированные люди, а также два дополнительных гликозита, 181NVT и 170NST. С 2003 года вирус H5N1 демонстрирует стремительную эволюционную динамику. При давлении отбора разных хозяев и антигенном дрейфе характер гликозита существующих вирусов H5N1 в разных географических точках был отличительным: HA в кладе 2.2.1.1, изолированном от Египта, не содержала 181N гликозита, но добавила гликозит 88NVS. Кроме того, НА в кладе 2.3.2.1, изолированном от Китая или Вьетнама, не обладала 170N гликозитом, но добавила 152N гликозита. Напротив, поскольку гликозиты в НА стали более разнообразными в вирусе H5N1, гликозилирование в NA ухудшалось уменьшающимся числом гликозитов. НС нынешних вирусов H5N1 лишены стеблевой области и четырех соответствующих гликозитов; за исключением четырех высококонсервативных гликозитов в глобальной области, другие гликозиты редко идентифицируются.

Гликопротеины оболочки, которые играют решающую роль в распознавании вируса, вторжении и распространении. Анализ гликозитов в HAs и NAs обеспечил основную информацию для разработки вакцин, отбора хозяев и изменения вирулентности. Однако инфекция представляет собой сложный процесс; чередование гликозитов и гликановых форм может влиять на функции гликопротеинов. Кроме того, существуют и другие мутации, заслуживающие дальнейшего изучения, такие как E627K в белке PB2, который усиливает способность репродукции вируса птичьего гриппа в клетках млекопитающих [76], [77]. Сопротивление лекарственным средствам также связано с вирусными белками, такими как белок M2 [78]. Таким образом, чтобы предотвратить появление новых пандемий гриппа, необходимо провести дополнительные исследования.

N-J деревьев H5N1 HA. Филогенетическое дерево было выведено из белковых последовательностей по методу соседей и внедрялось с использованием A / chicken / Scotland / 1959. Оценки статистической значимости филогении были рассчитаны путем выполнения 1000 копий бутстрапа. Клады, классифицированные ВОЗ, показаны как цветные полоски.

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Суперпозиция кристаллических структур из различных подтипов НА и Н. Красный, зеленый, синий и желтый цвета обозначают H1, H3, H5 и H7 в HAs или N1, N2, N8 и N9 в NA соответственно. (A) Вид сбоку глобального домена NA. (B) Вид снизу глобального домена NA. (C) Вид сверху глобального домена NA (D, E). Вид сбоку тримера HA.

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Аналитический файл выравнивания 146 репрезентативных HA и 93 репрезентативных NA-последовательностей.

(XLSX)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Консервативная скорость гликозитов в 17HA и 10 NA подтипах. Звездочка представляет собой те сайты, которые были вычислены только в полном домене.

(XLS)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Аналитический файл выравнивания, содержащий последовательности 3576 белков H5N1 HA. Как показано в выходном файле, все гликозиты отмечены красным цветом.

(XLSX)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Аналитический файл выравнивания, содержащий последовательности 2732 белка H5N1 NA. Как показано в выходном файле, все гликозиты отмечены красным цветом.

(XLSX)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Аналитический файл выравнивания, содержащий последовательности 5973 белка H3 HA. Как показано в выходном файле, красный, зеленый и синий цвета представляют уровни сохранения «> 95%», «5% ~95%» и «<5%» соответственно.

(ZIP)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

N-J деревьев H3 HA. Филогенетическое дерево было выведено из H3-HA-последовательностей методом N-J и внедрено с использованием A / equine / Miami / 1/1963 (H3N8). Оценки статистической значимости филогении были рассчитаны путем выполнения 1000 копий бутстрапа. 633 репрезентативных H3-HA-последовательностей вводили с учетом возраста, хозяев, областей, а также известных последовательностей HA из вирусов H3N1 и H3N3H3N7. Эти неконсервированные гликозиты маркируются (консервативная скорость <95%).

(PDFS)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Подтипы HA / NA и их репрезентативные штаммы.

(DOC)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Представительные идентификаторы HA / NA в PDB и их штаммы.

(DOC)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Источник: rupubmed.com


Leave a Comment

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Этот сайт использует Akismet для борьбы со спамом. Узнайте как обрабатываются ваши данные комментариев.